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MELpH


Projet MELpH

Mesure localisée du pH membranaire et de flux ionique de cellules en culture

MELpH logos
Départements : Optique - MN2S
Financement : Gouvernement Thaïlandais, ROP
Thèse en co-tutelle entre l'Université de Franche-Comté (France) et L'Université de Chian Mai (Thaïlande).

Projet débuté en Septembre 2013

Contexte

L’utilisation de la fluorescence comme source d’information sur le caractère sain ou pathologique des cellules n’est pas chose nouvelle. Cependant l’utilisation de la fluorescence pour mesurer des concentrations ioniques est plus marginale. Un des ions les plus courants et le proton H+ dont la concentration est directement liée au pH du milieu.

La possibilité de mesurer le pH interne d’une cellule sélectionnée dans un environnement complexe présente de nombreuses possibilités d’applications encore inédites en rapport avec l’importance de ce paramètre dans la physiologie cellulaire.

Celle-ci concerne un grand nombre de fonctions de communications cellulaires faisant intervenir des flux ioniques ; l’excitabilité cellulaire en général dépend des conditions locales de pH et ces propriétés sont particulièrement importantes pour les cellules nerveuses et gliales du système nerveux, mais aussi pour les cellules musculaires. Plus généralement, les récepteurs de nombreux facteurs de signalisation, dont les facteurs de croissance cellulaire sont associés à des flux ioniques s’accompagnant fréquemment de variations du pH intracellulaire.

Les grandes fonctions métaboliques sont également affectées, en effet, la plupart des enzymes impliquées dans la dégradation du glucose sont sensibles au pH. Enfin, de très nombreuses réactions de protection et de défense cellulaire impliquent des échanges ioniques et des variations du pH intracellulaire.

Par ailleurs, le déclenchement des plus grandes étapes du développement cellulaire, comme la prolifération, la migration, la différenciation et la mort, sont également marquées par des modifications du pH intracellulaire :

• La synthèse d’ADN en réponse à des agents mitogènes est le plus souvent liée à une alcalinisation cellulaire.
• Les protéines motrices de la cellule sont activées par des processus pH-dépendants.
• Différents modèles expérimentaux soulignent le fait que les conditions locales de pH peuvent moduler le programme de différenciation de cellules progénitrices.
• Parmi les phénomènes précédant l’apoptose, une baisse du pH intracellulaire est un facteur fréquent et parfois suffisant de déclenchement du programme de mort ; le maintien d’un pH constant peut alors protéger la cellule. Cette observation concorde avec le fait que l’activité de la DNAse est inversement corrélée au pH, et que la surexpression de protéines anti-apoptotiques inhibe l’acidification cellulaire.

Objectif

Il ressort de ce qui précède que le développement d’une méthode simple, rapide et mini- ou non-invasive de mesure du pH cellulaire rendrait des services inappréciables dans de multiples domaines en ajoutant de façon commode ce paramètre peu utilisé aux investigations classiques. C’est dans ce domaine que les travaux décrits ici trouveront leurs applications.

Le but est de mettre au point une sonde locale de fluorescence capable de mesurer la concentration en ion H+ et donc le pH. Un schéma de principe est donné sur la figure 1.

MELpH fig1

Figure 1 : Schéma de principe d’une sonde locale à mesure de pH et évolution du spectre du SNARF 1en fonction du pH (catalogue Invitrogen).

L’idée consiste à créer une pointe à l’extrémité d’une fibre optique par étirage ou polymérisation. Cette pointe est alors métallisée partiellement de manière à laisser son extrémité libre. La pointe est ensuite fonctionnalisée avec un fluorochrome sensible au pH (probablement le SNARF1 de la société Invitrogen). Au contact de la surface d’une cellule, le spectre de fluorescence détecté dépend très fortement du pH du milieu en contact avec le fluorochrome. L’aspect local de la mesure est obtenu par exploitation du phénomène de quenching qui « éteint » toute fluorescence émise au voisinage d’un métal. La pointe n’étant pas métallisée, c’est finalement le quenching qui donnera l’aspect local à la mesure.

Mise en œuvre

Nous procéderons par étapes de complexité croissante.
Les premières études concerneront le pH membranaire. Ces études seront menées avec des lames de microscope fonctionnalisées, la mesure de fluorescence se faisant à l'aide de sondes à fibre optique conventionnelles.

Dans un deuxième temps, nous validerons le concept avec des fibres clivées fonctionnalisées puis avec des zones actives relativement larges (1 à 2 microns) de manière à s’assurer d’un retour suffisamment intense du signal. Ce type de sonde est destiné à être utilisé dans un microscope de type SNOM. Ainsi, on pourra accéder simultanément à la topologie et la cartographie du pH membranaire (ou la cartographie d’autres ions comme indiqué ci-dessous).

Ensuite, nous étudierons les performances du système avec des pointes de plus en plus fines. Le but à terme est de réussir la mesure du pH avec des pointes suffisamment fine pour pouvoir pénétrer de manière minimalement invasives à l’intérieur des cellules.

Enfin, il faut noter que la transposition de cette technique à d’autres types d’ions est immédiate car les fluorochromes adaptés au Ca2+, K+,Cl- etc… sont disponibles sur le marché.


Partenaires

Université de Franche-Comté (lien) et plus particulièrement l'Institut FEMTO-ST.

Université de Chiang Mai (lien) et plus particulièrement le "Center of Excellence for Molecular Imaging" (lien).

Le CIC-IT du CHRU de Besançon (lien).


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