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Microscopie Référencée en Position

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Brièvement

Ce que nous appelons Microscopie Référencée en Position consiste à identifier la zone d'observation d'une préparation au microscope optique à partir d'un système de repérage qui est solidaire de la préparation elle-même. Ainsi, chaque image enregistrée est associée à sa position physique sur la préparation ce qui offre l'avantage de la retrouver facilement et rapidement lors d'observations ultérieures, par exemple après culture ou injection d'une drogue. Un logiciel spécifique assure un recalage extrêmement précis des images (au centième de pixel près) enregistrées à différents instants, leur comparaison donne ainsi un suivi site à site de l'évolution du milieu; ceci sur des zones d'intérêts librement choisies par l'expérimentateur et retrouvées à chaque séquence d'observation.

Ce projet est directement appliqué à la recherche sur le cancer du col utérin par nos partenaires biologistes du Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, EA3181, IFR 133 IBCT, à l'Université de Franche-Comté.

Principe et Technologie

Le principe consiste à insérer une mire codée semi-transparente dans la profondeur du support recevant la préparation biologique. Lors de l’observation sous microscope, on enregistre successivement l’image de la préparation et l’image de la mire codée en déplaçant légèrement la profondeur de mise au point de l’objectif. La position de la zone observée est obtenue par le traitement numérique de l’image de la mire codée.

La technique de codage est basée sur des séquences binaires pseudo-aléatoires cryptant une trame initialement périodique. La base périodique de la mire est mise à profit pour effectuer des calculs de phase qui assurent la très grande précision de la méthode (quelques millièmes de pixel image). En complément, les séquences binaires insérées fournissent une position plus grossière mais absolue par rapport à l'ensemble du motif. La combinaison de ces deux informations conduit à un repérage très fin sur de grandes étendues de codage. La résolution effective s'améliore avec le grossissement de l'objectif effectivement utilisé mais elle est déjà de l'ordre d'une quinzaine de nanomètres pour un grossissement de 10x.

En pratique, les mires de repérage de position sont réalisées par des techniques de photolithographie salle blanche sur des lamelles couvre-objets. Ces dernières sont intégrées à des boites de cultures habituelles et sont utilisées de façon standard pour la culture cellulaire.

mirePDMS

Exemple de mire pseudo-aléatoire réalisée en salle blanche, ici sur un suport plastique

Résultats

La figure ci-dessous donne un exemple de superposition de deux images d'une même zone observées à des instants différents après remise en culture de la préparation et retour sous le microscope. Ces images noir et blanc sont représentées dans les canaux rouge et vert d'une image couleur. La superposition des deux images donne alors la couleur jaune sur les parties communes. Les éléments fixés au support n'ayant pas évolués apparaissent avec un jaune uniforme tandis que le moindre déplacement se traduit par une dissociation rouge - verte des traits.

Superposées

Superposition de deux images d'une préparation de fibroblastes enregistrées en des instants différents

Cette méthode est actuellement exploitée avec nos partenaires biologistes pour suivre les déplacements d'éléments sub-cellulaires après l'induction médicamenteuse de la mort de cellules cancéreuses.

Publications internationales

P. Sandoz, R. Zeggari, L. Froehly, J.L. Prétet, C. Mougin, Position referencing in optical microscopy thanks to sample holders with out-of-focus encoded patterns, Journal of Microscopy, 225, (2007), 293-303.
J.A. Galeano Zea, P. Sandoz, L. Robert, E. Gaiffe, J.L. Prétet, C. Mougin, Position-referenced microscopy: regions of interest localization and subpixel image comparison by means of pseudo-random patterns embedded in cell culture boxes, European Conference on Biomedical Optics, 14-18 juin 2009, Munich, Allemagne, SPIE Proceedings Vol. 7367, DOI: 10.1117/12.831538.

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