De la recherche fondamentale au partenariat industriel

Plateforme tout-fluidique

Plateforme tout-fluidique pour le déplacement et le piégeage des ovocytes. Premières mesure de spectres d'absorption.

Présentation de la plateforme :

Précédemment, nous avons présenté une plateforme d'accueil des ovocytes. Son but est d'immobiliser les cellules sur les sites de mesure désirés. Cette immobilisation est obtenue grâce à un circuit de micro-fluidique. Lors de nos expérimentations, le système de piégeage de l'ovocyte par aspiration s'est révélé extrêmement performant. Nous avons alors décidé de mettre au point une plateforme d'accueil silicium dans laquelle tous les déplacements de l'ovocyte sont obtenus par micro-fluidique. On s'affranchit alors de toute pièce mobile dans le système. Il faut enfin noter que cette technique de manipulation présente toutes les garanties d’embryocompatibilité. En effet, les déplacements et le piégeage des cellules ne fait intervenir aucun champ que ce soit de nature électrique, acoustique magnétique ou encore optique. Un schéma de cette plateforme est donné sur la figure ci-dessous.

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Schéma de principe de la plateforme "tout fluidique".

Sur la face supérieure du composant, on usine une 'gouttière' de 200 µm de largeur par DRIE. Cette dernière sert à canaliser le liquide de vie cellulaire. Les élargissements ménagés aux extrémités de la gouttière sont les zones de dépôt et de collection des cellules. Une succession de micro-ouvertures (40 µm espacées de 2 mm) permet cette fois d'aspirer le liquide et de déplacer l'ovocyte d'une ouverture à une autre. Les ouvertures ainsi que les micro-sillons sont usinés par gravure KOH en face arrière du dispositif. Dans ce cas également, il a fallu prendre en compte les différentes sous-gravures de plans cristallins d'ordre élevé afin d'obtenir des structures parfaitement dimensionnées. Les techniques de compensation décrites ci-dessus ont donc été adaptées à la géométrie particulière de cette plateforme. L'étanchéité des canaux est obtenue par soudure anodique d'un wafer en verre. Ce dernier, percé par usinage diamant, permet de connecter les canaux au système extérieur de micro-fluidique. Dans cette version, des connecteurs microfluidiques commerciaux ont été préférés à ceux mis au point pour la plateforme initiale. En effet, si l'encombrement du système initial est satisfaisant, la mise en oeuvre de la connectique était très délicate à réaliser.

Systèmes de mesures optiques :

Pour cette plateforme, nous avons également intégré des sillons pour fibres optiques. Ces dernières constituent deux postes d'analyse. Un système de deux fibres (premier atelier), mesure les spectres d’absorption de la cellule et se comporte également comme un indicateur de fécondation. Une fibre émettrice permet d’illuminer la cellule avec une source de lumière blanche. La fibre réceptrice permet d’injecter la lumière ayant traversé l’ovocyte dans un spectromètre. Une mesure du spectre d’absorption est alors possible. Une troisième fibre (deuxième atelier) permet la mesure du pH membranaire de l'ovocyte. La mesure du pH membranaire repose sur l'utilisation d'une fibre clivée à l'extrémité de laquelle un fluorophore spécifique est déposé. La longueur d'onde de fluorescence variant avec le pH du milieu en contact avec la fibre, une mesure du pH membranaire peut être effectuée si l'ovocyte est en contact avec la fibre, d’où la forme particulière des butées de fibre et le positionnement excentré de l’ouverture d’aspiration. Les figures suivantes montrent des schémas de principe des ateliers de mesure optique. Il faut ici noter les formes particulières données aux butées de fibres dans les deux cas.

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Mesure du spectre d’absorption.

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Mesure du pH membranaire.

Réalisations expérimentales :

Sur les figures suivantes, on montre une vue générale de la plateforme. On y reconnaît notamment les zones de dépôt et de collection des cellules, ainsi que les sillons pour les fibres optiques. On montre également le réseau de micro-canaux et d'ouvertures sur la face arrière du composant. Les autres structures qui apparaissent sur ces clichés sont destinées au plaquage et au collage des fibres optiques. On remarquera la parfaite définition des butées de fibres et de l’ouverture d’aspiration. Sur la face arrière, on peut noter l’emploi efficace des structures de compensation lors de l’usinage KOH.

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Vues de la face supérieure de la plateforme (usinage DRIE).

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Vues de la face inférieure de la plateforme (usinage KOH et structures de compensation).

Le fibrage du composant a nécessité la mise au point d’un système dédié présenté sur la figure ci-dessous. On notera, entre autre, la partie amovible permettant de plaquer les fibres au fond de leurs sillons respectifs. La platine de translation permet une approche précise des fibres contre les butées. Les opérations de fibrage ont lieu sous binoculaire.

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Dispositif de fibrage de la plateforme.

Manipulation et piégeage de cellules :

Les figures ci-dessous montrent un exemple de manipulation d’ovocyte réalisée au CHU de Besançon. On peut remarquer le guidage de la cellule dans la gouttière. Il faut également noter le positionnement ultra-précis de la cellule au niveau des différents postes d’analyse. En particulier, l’ovocyte est parfaitement en contact avec la fibre de mesure de pH et également bien positionnée au entre les deux fibres de mesure de spectre d’absorption.

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Exemple de transport d’ovocytes.

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Piégeage ultra-précis des cellules.

La vidéo présentée ici (wmv, 652 Ko) montre un exemple de déplacement d'ovocyte sur le Lab-On-Chip.

Premières mesures des spectres d’absorption :

Pour l’heure, la mise au point du système de mesure de pH membranaire n’a pas encore fait l’objet d’études avancées. En revanche, des résultats encourageant ont été obtenus avec le système de mesure des spectres d’absorption. Les premières mesures ont été effectuées au CHU de Besançon avec la plateforme (ovocyte positionné comme présenté à la figure précédente). La figure ci-dessous montre un exemple de spectres obtenus sur un ovocyte non fécondé (à gauche) et sur un ovocyte après quelques méiose (à droite). Il apparaît clairement que ce type de mesure constitue un indicateur de fécondation particulièrement efficace.
Les résultats obtenus avec ce type de micro-capteur nous en encouragé à étudier les propriétés optiques des ovocytes de manière séparée de la plateforme de micro-manipulation. Dans la partie suivante, on présente un micro-système permettant une mesure simultanée de l’indice de réfraction, de l’absorption et du degré de maturité des ovocytes.

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Spectres d’absorption d’un ovocyte (gauche) et d’un ovocyte après quelques méioses (droite).

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