FEMTO-ST-Franche Comté Electronique Mécanique Thermique et Optique - Sciences et Technologies
Video de présentationDe la recherche fondamentale au partenariat industriel
Propriétés tribologiques des ovocytes.
Propriétés tribologiques des cellules : micro-indentation
Les propriétés mécaniques des ovocytes sont étudiées au moyen d'un indenteur. La technique d'indentation présentée dans ce premier exemple consiste à appliquer une très faible pression sur l'ovocyte à l'aide d'une micro-bille. La pression de la micro-bille sur l'ovocyte est obtenue grâce à un actionneur piézoélectrique. Suivant les caractéristiques physiques de la cellule, à charge égale exercée par l'actionneur piézoélectrique, le déplacement de la micro-bille va varier. En corrélant la pression exercée et le déplacement, on arrive à déterminer certaines caractéristiques physiques de la cellule (dureté, module d'Young…). La mesure du déplacement est effectuée avec une sonde optique à réflexion ou d'un traitement d'image dédié.
Indenteurs semi-massifs.
Une première approche, qu'on peut qualifier de semi-massive, a été étudiée. Une représentation du système est donnée en figure ci-dessous.
L'indenteur est constitué d'une plaquette de silicium dans laquelle une poutrelle est usinée. La rigidité de la poutrelle est une caractéristique essentielle puisqu'elle va dicter la sensibilité du système. A notre connaissance, il n'existe pour l'instant aucune donnée sur la dureté des ovocytes. Nous avons donc décidé de fabriquer des poutrelles présentant une raideur comparable à celle des cantilevers utilisés dans les microscope à force atomique (entre 0.01 et 10 N/m) même si dans le cas des ovocytes une telle raideur n'est peut-être pas requise. La poutrelle étudiée ici mesure 45 mm de long, 1 mm de large et 380 µm d'épaisseur. Des mesures faites avec le nano-indenteur du département de mécanique appliquée de FEMTO-ST ont permis de mesurer une rigidité de 8 N/m. Nous sommes donc dans la gamme de raideurs visée. Les expérimentations sur des ovocytes n'ont pas été concluantes. La raison en est principalement la dimension de l'indenteur qui rend extrêmement délicate son utilisation sur des cellules de 150 µm de diamètre. Nous nous sommes donc orientés vers la mise au point de micro-indenteurs silicium.
Schéma de principe et réalisation d'un indenteur semi-massif.
Micro-indenteurs silicium.
Cette étude est directement inspirée de travaux précédents concernant les propriétés tribologiques de la peau. Dans ce cas, les micro-indenteurs sont fabriqués par gravure anisotrope double face du silicium et comprennent trois parties distinctes: le corps de l'indenteur, la partie mobile et le système de mesure de déplacement (une sonde optique dans notre cas). La figure ci-dessous permet d'expliquer le principe de fonctionnement qui diffère sensiblement de celui des indenteurs semi-massifs. La partie mobile est reliée au corps du capteur au moyen de poutrelles extrêmement fines qui agissent comme des micro-ressorts. Une demi-sphere est collée sur la partie mobile. C'est elle qui entrera en contact avec l'ovocyte. La sonde optique est solidaire du corps du capteur et mesure le mouvement relatif de la partie mobile par rapport au corps. Dans un premier temps, on amène la partie mobile en contact avec la cellule. On abaisse ensuite l'ensemble du dispositif sur une distance connue. La force ainsi exercée sur la cellule se traduit par une réaction de cette dernière et par un mouvement relatif de la partie mobile par rapport au corps du capteur. C'est ce mouvement relatif qui permet la mesure.
Schéma de principe des micro-indenteurs.
Différents types d'indenteurs ont été fabriqués. Le dispositif de base présente des poutrelles de 1000 µm de longueur, de 500 µm de largeur et de 100 µm d'épaisseur. Des mesures effectuées avec un nano-indenteur montrent une raideur de 5960 N/m, largement supérieure à la gamme visée. Nous avons donc aminci les poutrelles en leur faisant subir une sur-gravure intentionnelle dans la potasse. La figure ci-dessous montre quelques exemples de poutrelles ainsi que leurs dimensions et leur raideur respectives.
Quelques exemples de micro-indenteurs silicium.
On remarque que les raideurs sont bien plus importantes que dans le cas d'un indenteur semi-massif. Augmenter encore la sur-gravure destinée à amincir les poutrelles conduirait à une fragilité excessive des dispositifs. Nous n’avons donc pas poursuivi dans cette voie.
Micro-indenteurs plans.
Les indenteurs que nous avons présentés jusqu’à maintenant mettent en jeu des parties mobiles se déplaçant perpendiculairement au plan du capteur. Cette architecture, si elle doit permettre d'estimer la dureté des cellules, pourrait poser des problèmes lors de l'intégration de ce capteur dans un micro-laboratoire dédié à la FIV. C'est pourquoi nous avons débuté la fabrication d'indenteurs dont la partie mobile se déplace dans le plan du capteur. Nous disposerons ainsi d'une architecture planaire qu'il sera plus facile d'intégrer au micro-laboratoire. La figure ci-dessous montre un exemple d'indenteur plan. On distingue la partie mobile et deux des quatre poutrelles de raccordement. Les poutrelles ont une longueur de 1.3 mm, une hauteur de 360 µm et une épaisseur de 70 µm. Avec une telle géométrie, la raideur est encore trop importante (plusieurs centaines de N/m), mais le concept d’indenteur plan a été validé.
Micro-indenteur plan en silicium.
En conclusion on peut dire qu’il paraît peut probable que de telles raideurs d’indenteurs soient compatibles avec les duretés supposées de ovocytes. A titre de comparaison, les plaquettes humaines présentent des duretés de l’ordre de quelques kPa. Garder le silicium comme matériau de base pour la fabrication des indenteurs ne paraît pas judicieux. C’est pourquoi nous avons mis à profit l’expérience acquise avec la résine SU8 pour étudier la fabrication d’indenteurs en résine.
Micro-indenteurs en résine SU8.
Nous avons donc choisi d’étudier la possibilité de remplacer le silicium par la résine SU8. En effet, cette résine présente un module d’Young de 5 GPa (contre 150 GPa pour le silicium), ce qui doit permettre d’obtenir de faible raideurs sans pour autant nécessiter des dimensions d’indenteurs trop importantes. Le principe de fonctionnement de ces indenteurs est illustré sur la figure ci-dessous. Considérons une poutrelle flexible attachée au substrat par une de ces extrémités. Un ovocyte est maintenu par la micro-pipette de contention et amené en contact avec la poutrelle. Après contact, on appuie l’ovocyte contre la poutrelle. Cette dernière étant flexible, on assiste d’une part à une flexion de la poutrelle et d’autre part à une déformation de la cellule. On connaît la raideur k de la poutrelle. On mesure sa déflexion X, et on en déduit la force de contact entre la cellule et l’indenteur F=kX. On mesure ensuite le diamètre d de contact entre la cellule et la poutrelle, et on en déduit la dureté de l’ovocyte : H=4F/
d^2.
Par ailleurs, le modèle de Hertz décrit la déformation de deux sphères en contact, constituées de matériaux et présentant des rayons différents. Si on assimile la poutrelle à une sphère de diamètre infini et si on considère que son module d’Young réduit est très supérieur à celui de la cellule, on peut exprimer le module d’Young de l’ovocyte de la manière suivante : 6FR/d^3 (avec R le rayon de l’ovocyte).
Principe de fonctionnement d’un indenteur planaire.
Différents indenteurs ont été réalisés. La méthode de fabrication repose sur une double lithographie de résine SU8 sur substrat silicium, suivie d’une étape de DRIE et d’un découpage des composants à la scie de précision. Pour utiliser les indenteurs, il faut les retourner de manière à ce qu’ils reposent sur la deuxième couche de SU8 ainsi qu’il est décrit sur la figure ci-dessous. Les épaisseurs des deux couches de résine sont calculées de sorte que la poutrelle de l’indenteur soit au mieux centrée sur l’ovocyte.
Principe de fabrication d’un indenteur plan en SU8.
La figure suivante montre un exemple d’indenteur réalisé par cette technique. On remarque la double couche de SU8 sur le cliché de droite. Dans cet exemple les dimensions de la poutrelle sont 2000*190*80 µm3, ce qui conduit à une constante de raideur k=15 N/m, pratiquement dans la gamme visée.
Quelques exemples d’indenteurs en résine SU8.
D’un point de vue expérimental, nous n’avons pour le moment effectué qu’un seul essai sur un ovocyte au CHU de Besançon. La figure csuivante (en haut) montre des images prises avant contact et sous charge. On remarque que malgré sa faible raideur, la poutrelle reste encore trop rigide pour apprécier sa flexion de visu. Un traitement d’image a été mis au point pour déterminer la flexion de la poutrelle et le diamètre de contact entre l’indenteur et la cellule (figure suivante, en bas). Ces mesures conduisent à une dureté de 4 kPa et un module d’Young réduit de 12 kPa. Ces valeurs, bien que cohérentes pour des cellules biologiques, restent toutefois à prendre avec circonspection. La très faible flexion de la poutrelle et la très grande déformation de la cellule sous charge peuvent conduire à une erreur significative sur les valeurs déterminées. Nous sommes actuellement en train de fabriquer des indenteurs présentant des raideurs bien inférieures et nous espérons ainsi pouvoir conduire une série de mesures sur un nombre important de cellules dans un avenir proche.
Premier test de mesure de dureté des ovocytes et traitement d'image dédié.
Dernière modification : 2007-05-25
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