Daniel GUNEYSU : "Dispositif intégré microfluidique pour la qualification de Vésicules Extracellulaires : mise au point de calibrants biomimétiques et de biopuces d'immunocapture"

Résumé : Le projet ANR MADNESS a pour objectif de proposer une solution analytique de tri et de qualification de vésicules extracellulaires (EVs) contenues dans un milieu biologique complexe. La thèse a porté sur le développement d’un module de capture des EVS ainsi que sur le développement d’un panel de calibrants internes de nature synthétique permettant de certifier les performances du module de capture.
Le module NanoBioAnalytique (ou NBA) est une solution miniaturisée d’immunocapture des EVs qui sera positionné en aval dans la solution globale MADNESS. Le module a pour ambition de suppléer les phases d’immunocapture dans des équipements de biodétection comme la SPRi. Une détermination des paramètres fluidiques a été engagée par simulation des écoulements sur Comsol® et vérifiée par tests microfluidiques (détermination des gammes de pression à appliquer, de la correspondance avec les débits). La fonctionnalité de l’immunocapture a pu être validée au travers de différents modèles biomimétiques microparticulaires (mimant les Evs) : des particules de 140 et 480 nm de diamètre ont été biofonctionnalisées, avec deux protéines standard : la caséine (CAS) et l’ovalbumine (OVA). Les NPs résultantes dénommées NP140-CAS / NP140-OVA et NP480-OVA seront utilisées comme calibrants internes lors des processus d’immunocapture. Les protocoles de préparation incluant les caractérisations biochimiques et biopysiques ont été validés et servent à la préparation de modèles pour l’ensemble de la chaine préparative et analytique de la solution MADNESS. Les paramètres de biodétection en termes de gamme dynamique et de limite de détection ont été déterminés en solution tampon (entre 107 particules par ml et 109 particules par ml pour l’ensemble des calibrants). Une validation de leur rôle a été faite en échantillon complexe par ajout additionnel aux vésicules extracellulaires naturelles. De cette façon, nous avons pu établir l’absence de réactions croisées sur les spots d’immunocaptures ainsi que la capacité à pouvoir les utiliser indifféremment dans des milieux soit contrôlé soit biologique.
Une dernière étape a pu être franchis dans le projet MADNESS avec une première configuration de couplage entre le dispositif de tri (développé en parallèle au LAAS) et le module NBA. En dépit de conditions expérimentales limites (débit, durée, concentration…), le module a montré une bonne efficacité de fonctionnement (sensibilité et spécificité) dans des milieux de complexité croissante contribuant ainsi à une solution MADNESS performante en plasma humain.
Les travaux ont été valorisés à travers la présentation de plusieurs communications scientifiques (poster et communication orale) dans des conférences nationales et internationales et de la publication d’un article dans une revue à comité de lecture.  

Composition du jury :

Wilfrid BOIREAU, Directeur de recherche, Université Bourgogne Franche-Comté, Directeur de thèse

Anne-Marie GUE, Directrice de recherche, LAAS-CNRS, Examinateur

Eric LESNIEWSKA, Professeur, ICB université de Bourgogne, Examinateur

Céline ELIE-CAILLE, Maîtresse de conférences, Université Bourgogne Franche-Comté, CoDirecteur de thèse

Jérome DEJEU, Maître de conférences, Université Grenobles-Alpes, Rapporteur

Joel CHOPINEAU, Professeur, Institut Charles Gerhardt, Rapporteur

Localisation : Amphitéâtre Jean-Jacques Gagnepain, 15 B avenue des Montboucons 25000 BESANCON